DNA diagnostika, praktické postřehy pro základní vybavení laboratoře přístroji a metodikou I.

• | Tisk |

Podrobnosti

Vytvořeno 11. červen 2008

Napsal Mirka Horáková

Nejčastější metodou používanou pro zjištění přítomnosti či nepřítomnosti specifického úseku DNA ve vzorku je polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR je velmi citlivá metoda, která zachytí a amplifikuje již několik málo kopií DNA. Detekce PCR produktů (krátkých úseků DNA o specifické sekvenci) může být provedena třemi základními způsoby, čehož využívají i výrobci DNA diagnostiky.

Nejjednodušší je detekce samotných PCR produktů v gelu, agarózovém nebo polyakrylamidovém. Této metodě se říká elektroforéza a využívá skutečnosti, že DNA představuje nabitou molekulu a je schopna se pohybovat v gelu, kterým probíhá elektrický proud. Přitom platí, že čím kratší a konformačně nenáročnější molekula DNA, tím delší dráhu je schopna "uběhnout". DNA v gelu je poté ošetřena interkalačním barvivem (např. ethidiumbromid), které je excitováno UV zářením a DNA je tak zviditelněna.

Další možností je detekce PCR produktu pomocí změn v emisi fluorescenčního záření, k němuž dochází přímo v průběhu jedné z variant PCR, které se říká real-time PCR (PCR v reálném čase). Tato varianta je v dnešní době velmi populární a perspektivní a je zaváděna či prováděna v mnoha laboratořích.

Poslední možností je detekce PCR produktů pomocí hybridizace. Velmi spolehlivou, ale možná částečně opomíjenou metodou DNA diagnostiky, je tzv. reverzní hybridizace značeného PCR produktu se specifickou sondou. Sonda je navázána na mikrodestičce nebo na stripu a představuje krátký úsek DNA komplementární k PCR produktu. PCR produkt je denaturován a výsledná hybridní molekula DNA je detekována barevnou reakcí, na stripu se objeví viditelný proužek, nebo emisí záření při určité vlnové délce.




Vybavení pro tuto variantu patří k levnějším, je nutné zakoupit PCR cykler, který umožní amplifikaci specifické DNA sekvence. Cena kvalitního přístroje začíná přibližně na 140 000 Kč.

Dále je nutné pořídit vybavení pro elektroforézu, tedy zdroj napětí, zařízení pro agarózovou nebo polyakrylamidovou elektroforézu a také detekční zařízení, jehož nejlevnější variantou je transiluminátor a fotoaparát. Celková cena základního přístrojového vybavení pak nepřesáhne cca 230 000 Kč. Nevýhodou této nejpůvodnější varianty je časová náročnost (cca 4-5 hodin), nepříjemná manipulace s toxickými interkalačními barvivy i možné problémy s interpretací výsledků, které někdy vyžadují radu zkušeného odborníka. Metoda neumožní stanovení přesného množství DNA ve vzorku, je pouze kvalitativní.

Velké množství výrobců nabízí certifikované soupravy pro detekci konkrétního úseku DNA. Mnoho laboratoří také využívá své vlastní aplikace, které vznikly přizpůsobením postupů publikovaných v odborných časopisech. Výsledná cena vyšetření jednoho pacienta se pak pohybuje v rozmezí 150 - 500 Kč.

Finanční náročnost real-time PCR

Vybavení pro tuto variantu je nejdražší. Cena kvalitního přístroje začíná přibližně na 800 000 Kč. V dnešní době ovšem tato metoda prožívá velký rozkvět. Je totiž tzv. "vše v jednom". Amplifikace i detekce příslušného úseku DNA probíhá současně a přístroj umožňuje sledování průběhu reakce na displeji počítače.

Velkou výhodou je možnost kvantitativního stanovení, lze zjistit přesné množství určité DNA, popř. RNA ve vzorku. Real-time PCR je velmi spolehlivá, vyžaduje ovšem velmi precizní manipulaci při přípravě vzorku. Je také, oproti jiným metodám časově nenáročná. Výsledek analýzy může být znám už za 45 minut!

Také v tomto případě existuje velké množství komerčních souprav, které však často bývají šity na míru pouze třem nejpoužívanějším real-time cyklerům značek Rotor-Gene (Corbett Research), LightCycler (Roche) a ABI (Applied Biosystems). Mnohé firmy také dodávají pouze jednotlivé komponenty real-time PCR nezbytné pro detekci specifického úseku nebo jsou schopny je připravit podle požadavků zákazníka. Výsledná cena jednoho stanovení začíná na 150 Kč.


Druhý díl "DNA diagnostika, praktické postřehy pro základní vybavení laboratoře přístroji a metodikou II." bude zveřejněn v pátek 13.6.